今天是一年一度的端午节，在此祝福大家端午安康，希望远方的你们无论是否有家人相伴，都要照顾好自己，幸福快乐，粽子吃起来！
文献也要读起来！
废话不多说，上课！
卵巢癌是女性最致命的妇科恶性肿瘤，近70%的卵巢癌病例为高级别浆液性癌(HG-SC)亚型，由于缺乏有效的筛查工具，因此该亚型通常被发现时已为晚期。
HG-SC在分子特征上与其他亚型卵巢癌有很大的不同，因此发现HG-SC的特异性分子对于理解其潜在发病机制和设计个体化治疗方案至关重要。
KalpanaKannan等人于年在PLOSONE杂志上发表CDKN2D-WDFY2是高级别浆液性卵巢癌中的一种癌症特异性融合基因一文，对于发现卵巢癌的特异性分子具有重大的临床意义。
接下来，我们一起来学习这篇文章吧！
结果
1、高级别浆液性卵巢癌新融合转录本的鉴定
测序+分析一通操作猛如虎鉴定出了6个候选融合转录本，由于操作较为复杂，此处省略一万字。。。感兴趣的同学可以看原文。
2、CDKN2D-WDFY2存在于多种癌症样本中
为了评估这6个候选融合转录本的出现频率，作者用RT-PCR检测了28例HG-SC患者样本中它们的表达。
同时，对10例非癌性卵巢标本（OV）和4例非癌性输卵管标本（FT）进行RT-PCR检测。
结果显示，6个融合转录本中的2个仅在癌症组中被发现，这意味着它们是癌症特异性的，其中CDKN2D-WDFY2的出现频率最高。
为了进一步评估其发生频率，作者将队列大小增加到60个HG-SC样本，发现该融合转录本存在于20%(12/60)的HG-SC样本中，而在所有非癌性卵巢和输卵管样本中均不存在，进一步证明它是癌症特异性的。
前面的研究证明CDKN2D-WDFY2是一种在卵巢癌样本中高频率出现的融合转录本，因此作者推测该融合转录本可能也存在于HG-SC细胞系中。
事实的确如此，作者通过对5个浆液型细胞系(CaOV3、OV-90、OVCAR8、OVCAR5和OVCAR3)和2个子宫内膜细胞系(TOVD和MDAH)进行RT-PCR筛选，发现CDKN2D-WDFY2融合转录本在OV-90中有表达，而在其他细胞中均不表达。
CDKN2D-WDFY2在HG-SC细胞系(OV-90)中的存在进一步支持其在HG-SC中的潜在意义。
3、CDKN2D-WDFY2是由染色体重排产生的融合基因
CDKN2D位于19号染色体，而WDFY2位于13号染色体。
为了确定这个融合转录本是染色体重排的结果，还是反式剪接的结果，作者在患者S5的肿瘤中搜索了CDKN2D-WDFY2的基因组断裂点。
通过设计几个引物来扩增WDFY2的内含子2(14kb)中的不同位置，并且这些引物与针对CDKN2D的外显子1(1kb)的引物配对。
接下来，作者通过使用一种特定的引物组合对患者肿瘤基因组DNA进行长距离PCR扩增得到了大约3kb的单个扩增带。
凝胶纯化和Sanger测序揭示了精确的基因组断裂点，它位于CDKN2D外显子1末端的bp和WDFY2外显子3上游bp。
结果证明，CDKN2D-WDFY2是由染色体重排产生的融合基因。
4、CDKN2D-WDFY2导致CDKN2D蛋白表达缺失，获得短的WDFY2蛋白亚型
CDKN2D-WDFY2在患者肿瘤中的高发生率提示这种基因融合可能在肿瘤中发挥重要作用。
目前一个重要的问题是，这种基因融合是否会导致异常蛋白的表达。
根据对融合转录本中“开始”和“停止”密码子的分析，CDKN2D的外显子1与WDFY2的外显子3的融合可能产生两个翻译结果：
第一个是短的CDKN2D蛋白，从随后的框外WDFY2序列中添加了16个新的氨基酸，产生了7kD的蛋白；
第二个是短的WDFY2蛋白，由一个与亲本基因终止密码子相连的内部翻译起始点产生。
为了研究融合基因的翻译结果，作者克隆了包含CMV启动子(质粒1)控制下的两个ORF的全长融合转录本(取自患者S5)。在带有WDFY2的C端处插入了标签。第二个质粒是在同一CMV启动子的控制下构建的，但是只含有带有C-末端标签的截短CDKN2D的ORF(质粒2)。
抗FLAG抗体显示质粒1表达的WDFY2蛋白，Western分析显示，在未转染的细胞(泳道1)中没有36kDa的蛋白表达，而在转染的细胞中有36Kd蛋白的表达（泳道2），表明短的WDFY2确实被翻译了，并可预测其大小。
相反，抗CDKN2D抗体显示，当质粒1转染时，截短的CDKN2DORF没有被翻译(泳道6)，而当转染只包含该ORF的质粒2时，抗CDKN2D抗体可以容易地识别截短的CDKN2D蛋白(泳道3和5)。
WDFY2是一种具有7个WD重复序列的内体蛋白，被认为是一个促进激酶与其底物之间相互作用的“对接站”。
研究表明WDFY2可以与AKT及其底物结合，作者推测，由于短的WDFY2蛋白亚型只包含7个WD重复序列中的5个，因此可能会影响AKT与其底物的相互作用，从而改变下游信号转导。
为了探索短WDFY2和野生型WDFY2在信号通路上的功能差异，作者进行了反相蛋白阵列法(RPPA)，来定量评估种癌症相关蛋白水平。
作者将转染ShortWDFY2的HG-SC细胞系(OVCAR8)与野生型WDFY2进行比较，并将患者样本S5(表达CDKN2D-WDFY2融合转录本)与S19(不表达融合转录本)进行比较。
分析发现，患者S19和S5之间有99个蛋白质发生显著变化，野生型WDFY2和ShortWDFY2转染的细胞系之间有53个蛋白质发生显著变化。
为了确定因短WDFY2的表达导致显著变化的那些蛋白，作者在转染的细胞系和患者样本中搜索，发现了17种差异表达的蛋白质。
接着，作者用传统的Western实验进一步证实了其中3种蛋白质的表达水平。
此外，作者还证实，经过RPPA分析的OVCAR8细胞具有相似水平的野生型和短WDFY2。
因此，在RPPA分析中发现的差异不是由于野生型和短WDFY2在细胞系中表达水平的不同，而可能是由于它们的蛋白活性不同所致。
然而，由于没有合适的抗体，作者无法确定患者s5和s19的内源性野生型和短WDFY2蛋白表达水平。
为了进一步研究短WDFY2的表达可能显著改变哪些信号通路，作者对RPPA数据进行了通路分析。
结果发现，PI3K/AKT通路在这组17个蛋白中高度表达，在转染的细胞系和患者组织中表现出相同的变化。例如，AKT的底物BAD和FOXO3a在表达Short和野生型WDFY2的细胞系中以及在患者S5和S19中发生了显著变化。
这一结果表明，短WDFY2的表达可能改变了PI3K/AKT通路，进而促进了HG-SC的肿瘤进展。
讨论
文章发现，CDKN2D-WDFY2融合导致野生型CDKN2D和野生型WDFY2的翻译丢失，并获得了可能受CDKN2D启动子控制的短WDFY2蛋白亚型。
CDKN2D功能缺失既影响细胞周期调节，也影响DNA的修复，这意味着修复DNA损伤的能力减弱，可能导致HG-SC中基因突变和染色体重排的增加。
而短WDFY2蛋白的可能会改变PI3K/AKT途径，然而，由于缺乏相应的抗体，目前的研究不能确定患者样本中存在短WDFY2蛋白。
CDKN2D-WDFY2融合基因具有多种潜在的临床价值。
1、可以用于疾病的分层，即识别HG-SC患者的亚型，从而进行个性化治疗。
2、如果证实该融合基因是致癌的，那么短的WDFY2蛋白也可以作为小分子药物的治疗靶点。
3、该融合基因可以作为临床生物标记物用于非侵入性检测一部分的HG-SC。
好了，今日文献分享完毕，我要去吃粽子了
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